本试剂盒基于BCA法（二喹啉甲酸法，Bicinchoninic Acid Assay），是Lowry法的一种改良形式，由两个连续反应组成。第一步，还原反应：在强碱性条件下，蛋白质分子中的肽键将工作液中的Cu²⁺还原为Cu⁺。该还原反应的程度主要取决于蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸和酪氨酸等氨基酸残基的含量，并与蛋白质浓度成正比。第二步，显色反应：每个被还原生成的Cu⁺离子与两分子BCA试剂（二喹啉甲酸）发生特异性螯合反应，生成一种水溶性的紫色络合物。

该紫色络合物在562 nm波长处有强烈的特征吸收峰。在一定蛋白质浓度范围内（通常为20–2000 μg/mL），562 nm处的吸光度与蛋白质浓度呈良好的线性关系。通过与标准蛋白（如BSA）绘制的标准曲线对比，即可定量计算待测样品的蛋白质浓度。

以微孔板酶标仪法为例：

1.     用PBS将待测蛋白样品进行适当稀释，可多做几个梯度(如2、4、8倍)；

2.     配制BCA显色工作液：

a. 用量计算：工作液总量 = (空白对照数＋标准品样本个数＋待测样本个数)×复孔数×200 μL(每样本所需显色工作液体积)；

注意：建议多配2～3个孔的量以补偿加样误差。

b. BCA工作液配制：将试剂A与试剂B以 50:1比例混匀（例：5 mL A + 100 μL B）， 24h内使用。

3. 定量检测：

a. 加样：将各标准品及样品以20 μL/孔加至96孔板中；

注意：需设置空白对照，该孔添加20 μL稀释液。

b. 显色：每孔加入200 μL BCA工作液，充分混匀，盖上板盖，在37 °C孵育30 min；

注意：也可以室温孵育2 h，或在60°C孵育30 min。低丰度样品可延长时间或提高温度。

c. 读值：冷却至室温，酶标仪读取波长562 nm处光吸收值。

注意：也可读取540–595 nm任意波长处光吸收值。标准品及样品孔要减去空白对照的吸光度。

4. 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度：

a. 以最小二乘法绘制标准曲线（应舍弃明显离群的数值），线性方程的R² ≥ 0.99时方可使用该方程计算蛋白质含量；

b. 将样品吸光度代入线性方程，得稀释后蛋白浓度，最后乘以稀释倍数，得原始蛋白浓度。