服务介绍/Introduction
Western Blot是一种常用的分子生物学技术，常用于检测复杂样品（细胞或组织裂解液）中目标蛋白的分子量、表达量及翻译后修饰等检测。
其原理为：在SDS作用下，蛋白质变性并带均匀负电荷，不同分子量的蛋白质在凝胶中电泳速率不同的，使用垂直凝胶电泳分离蛋白，再通过电场作用，将带负电的蛋白质从凝胶迁移到 膜上，进而通过“抗原-抗体”特异性结合原理，实现对特定蛋白质的检测。
适用场景
✪ 蛋白表达量检测：比较不同样品（如给药前vs给药后、病变vs正常）中目标蛋白的含量变化；
✪ 翻译后修饰分析：使用特异性抗体检测磷酸化、乙酰化等修饰状态；
✪ 蛋白互作验证：结合Co-IP等技术确认蛋白间是否存在结合；
✪ 疾病标志物研究：在临床样本中筛查或验证潜在的诊断或预后标志物。
特色服务
✪ 提供定性与半定量分析；
✪ 适配多类型样本，如细胞、组织、血清等；
✪ 提供灰度值量化，结果更加直观；
✪ 适合复杂组分验证。
服务流程/service process
客户提供/Customer provides
样品信息
✪ 指标信息：含蛋白质名称、分子量大小等；
✪ 抗体信息：一抗≥10μL/次(需明确抗体品牌、货号及稀释比推荐)；如抗体为初次使用的新抗体，需附抗体说明书。
注：若需我方提供抗体，请明确目标蛋白名称、种属及品牌要求。
送样要求
✪ 细胞：1×107个细胞，离心后收集细胞沉淀；干冰运输。
✪ 组织：动物组织不少于0.2 g；植物组织不少于0.5 g；干冰运输。
✪ 样品：已提取的总蛋白(含蛋白酶抑制剂) ≥ 200 mg，浓度 ≥ 1 mg/L；干冰运输。
交付内容/Delivered content
✪ 全部原始胶图
✪ 灰度值分析图
✪ 检测实验报告
服务说明/Service Specification
常见问题/Service
Specification
Q：
Co-IP 跑 WB 时IgG 重链 / 轻链干扰（50 kDa / 25 kDa），盖过目标条带怎么办？
A：
主要问题是IP 抗体与二抗交叉反应、抗体用量过大。要换不同物种 IP 抗体 + 对应二抗、用共价偶联珠子、IP 后用甘氨酸 pH 2.8 洗脱再 WB、用轻链特异性二抗。
Q：
多抗做 WB 时，条带总是有非特异性信号，该怎么优化？
A：
多抗检测容易出现非特异性背景干扰，可从多个实验环节进行优化改善：通过梯度稀释一抗筛选出最佳工作浓度，适当延长封闭时长并选用含 0.1% Tween-20 的封闭液，同时增加 TBST 洗涤次数以有效降低背景干扰；选用脱脂奶粉或 BSA 进行封闭时，需留意抗体适配性与交叉反应问题，尤其是磷酸化抗体应避免使用牛奶封闭，必要时可直接更换特异性更强的单克隆抗体，从根源减少非特异性杂信号。
Q：
WB 条带中间出现白色圆圈（白圈），该怎么解决？
A：
WB 条带出现白圈现象，大多是转膜过程中产生气泡所造成，主要是转膜组装三明治结构时胶与膜之间残留气泡，阻碍了蛋白正常转移，也可能是转膜温度过高滋生气泡或是膜活化不充分所致；实验组装时需用玻璃棒轻轻滚压彻底排尽气泡，同时采用预冷转膜缓冲液，并全程在冰浴条件下进行转膜操作即可避免该问题。
Q：
WB 条带出现 “微笑 / 皱眉” 形状，是什么问题？
A：
WB 条带出现变形多与电泳操作环节密切相关，主要原因包括凝胶配制时聚合不均匀或内部残留气泡、电泳电压过高使凝胶发热造成蛋白迁移不均，以及上样量过大或样本盐浓度偏高干扰正常迁移速率；实际实验中可通过降低电泳运行电压、保证凝胶充分完全聚合、优化样本缓冲液配比等方式，有效改善条带变形的问题。
Q：
磷酸化蛋白 WB 实验中，条带总是检测不到，可能是什么原因？
A：
磷酸化蛋白的免疫印迹检测难度相对更高，实验失败大多源于样本处理环节，常见原因有蛋白提取过程中未添加磷酸酶抑制剂，致使磷酸化蛋白发生快速去磷酸化；磷酸化蛋白本身表达丰度偏低，实验上样量不足；转膜效率不佳，磷酸化蛋白无法完整有效地转移至膜上；另外抗体对磷酸化位点识别灵敏度不足，或是样本中目标磷酸化位点本身未被激活也会导致无条带。实验全程建议低温操作，同时优化蛋白裂解与转膜各项条件，即可明显提升磷酸化蛋白的检测成功率。
Q：
WB 条带位置和预期分子量不符，该怎么排查？
A：
条带位置偏差的常见原因：① 蛋白存在翻译后修饰（如糖基化、磷酸化），会导致分子量偏移；② 存在转录异构体或蛋白剪切产物；③ 凝胶浓度选择不当（如小分子蛋白用高浓度胶）；④ 电泳条件不稳定，导致迁移率异常。可结合文献和阳性对照验证条带特异性。
Q：
WB 条带出现很多杂带，是什么原因？
A：
WB 实验中条带出现杂带的主要成因包括：一抗特异性较差，存在非特异性结合；一抗或二抗浓度过高，导致非特异性信号增强；封闭不彻底，膜上的非特异性位点未被有效封闭；样本中蛋白发生降解或存在非特异性杂蛋白干扰；以及电泳时上样量过大，超出了抗体的识别能力。针对这些问题，可通过梯度稀释抗体找到最佳工作浓度、优化封闭条件以减少非特异性结合、增加样本纯化步骤来去除杂质，从而有效改善杂带问题。
Q：
WB 背景很高、整片发黑，该怎么解决？
A：
WB 实验中背景信号过高通常与封闭、抗体孵育及洗涤环节相关：首先要排查封闭是否充分，可通过延长封闭时间（如延长至 2 小时）或更换封闭液改善，例如使用 BSA 替代脱脂奶粉，避免内源性磷酸酶对磷酸化抗体检测的干扰；其次可能是抗体浓度过高，可适当降低一抗与二抗的稀释比例，减少非特异性结合；此外洗涤不充分也会导致背景升高，建议增加 TBST 的洗涤次数并延长每次洗涤的时间；最后还需注意实验操作的规范性，避免用手直接接触膜，使用干净的耗材，防止膜被污染而造成背景异常。
Q：
WB 条带信号很弱，如何增强信号？
A：
可以从以下环节优化：
① 增加蛋白上样量（确认样本无降解）；
② 降低一抗稀释比例，延长 4℃孵育时间；
③ 优化转膜条件，确保蛋白高效转移；
④ 使用灵敏度更高的发光试剂；
⑤ 调整曝光时间，或改用荧光 WB 系统提升检测限。
Q：
WB 实验中完全没有条带信号，可能是什么原因？
A：
常见原因包括：
① 目的蛋白在样本中表达极低或不表达；
② 蛋白降解（未加足量蛋白酶抑制剂、反复冻融）；
③ 转膜失败（蛋白未转移到膜上或转过凝胶）；
④ 一抗 / 二抗不匹配、浓度过低或孵育时间不足；
⑤ 曝光时间过短或检测系统灵敏度不足。可通过加入阳性对照、优化转膜条件和抗体浓度排查。
Q：
对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？
A：
对于贴壁细胞，采用转染试剂转染即可；对于比较难转染的细胞，为提高转染效率，可选购特殊要求的转染试剂或者使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法未必是最佳的；转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测等方法，但最终以达到基因过表达或者干扰的效率为准。
