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                    磷酸化修饰
磷酸化修饰
适配多类型样本
定性或半定量分析
修饰位点鉴定
信号通路分析
服务特色
1.目标蛋白磷酸化修饰状态定性与半定量分析,适用于组蛋白、代谢酶、转录调控因子等不同类型蛋白;
2.可检测目标蛋白在不同处理及疾病模型下的磷酸化相对丰度;
3.适配多种样本类型(原代细胞、组织、临床样本、血液等);
3.磷酸化修饰位点精准定位;
4.结合RNAi、CRISPR等手段,验证目标蛋白磷酸化修饰对对上游信号或干预条件的响应。
服务介绍
服务流程
客户提供
交付内容
服务说明
常见问题

服务介绍/Introduction

磷酸化修饰是最常见、研究最深入的蛋白质翻译后修饰之一,通过激酶将磷酸基团共价连接至蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基,参与调控细胞信号转导、细胞周期、代谢、转录、凋亡及免疫应答等多种生物学过程。

本平台提供专业的磷酸化修饰检测与分析服务,支持细胞、组织及临床样本等多种生物材料。采用泛磷酸化抗体富集结合高分辨率质谱(LC-MS/MS)策略,或针对特定蛋白的免疫共沉淀(Co-IP)联合Western blot检测,可对目标蛋白的磷酸化修饰状态进行定性、半定量及修饰位点解析。适用于信号通路解析、激酶抑制剂筛选、肿瘤机制研究及药物靶点发现等领域,结果稳定可靠。

5.磷酸化修饰.jpg

适用场景

 基础科研:研究磷酸化对蛋白稳定性、定位、上下游信号及生理机制的影响;

✪ 疾病机制:揭示异常磷酸化在癌症、阿尔茨海默症、炎症与免疫中的作用;

✪ 药物开发:研究磷酸化修饰促癌机制、免疫逃逸机制,发现相关疾病靶点,并评估泛素化转化酶抑制剂的药效与机制。

农业与微生物学研究磷酸化修饰促癌机制、免疫逃逸机制,发现相关疾病靶点。


特色服务

✪ 基础质量评估与蛋白定量:对质谱数据进行全面评估,涵盖数据完整性、准确性及可靠性等多维度考量,精准鉴定样本中的蛋白质,并实现定量分析,为后续研究奠定坚实的数据基础。

✪ 功能通路解析:运用GO和 KEGG分析手段,深入剖析磷酸化修饰蛋白的功能特性,明确其所参与的生物学通路,揭示其在生命活动中的潜在作用机制。

✪ 蛋白互作与结构解析:构建磷酸化修饰蛋白的相互作用网络,直观呈现蛋白间的关联关系;同时,深入分析修饰位点所在的结构域,从结构层面理解磷酸化修饰对蛋白功能的影响。

✪ 表型关联与实验方案设计:将磷酸化修饰蛋白与生物学表型进行紧密关联,筛选出与特定表型密切相关的关键蛋白;并据此为后续的验证实验提供科学、合理且具有针对性的实验方案。


服务流程/service process

服务流程图3.png

客户提供/Customer provides

样品信息

✪ 目标蛋白:含名称、分子量大小等;

✪ 抗体信息:磷酸化抗体或泛磷酸化抗体,≥10 μg/样(需明确使用比推荐);

注:若需我方提供抗体,请明确目标蛋白名称、种属等基本信息。


送样要求

✪ 细胞:1×107个细胞,离心后收集细胞沉淀;干冰运输。

✪ 组织:动物组织不少于0.5 g;植物组织不少于1 g;干冰运输。

✪ 样品:已提取的高纯度蛋白样品 ≥ 500 μg(需提供定量结果);干冰运输。

✪ 血液样品:≥  2 mL全血(含EDTA或肝素抗凝);干冰运输。

✪ 阳性参照:对照蛋白样本或细胞裂解物,用于验证实验体系。

注:特殊条件及样品请详询。

交付内容/Delivered content

✪ 全部原始数据

✪ 灰度值分析图

✪ 质谱分析图谱

✪ 检测实验报告

服务说明/Service Specification

磷酸化.jpg

常见问题/Service Specification

Q: 多抗做 WB 时,条带总是有非特异性信号,该怎么优化?
A: 多抗检测容易出现非特异性背景干扰,可从多个实验环节进行优化改善:通过梯度稀释一抗筛选出最佳工作浓度,适当延长封闭时长并选用含 0.1% Tween-20 的封闭液,同时增加 TBST 洗涤次数以有效降低背景干扰;选用脱脂奶粉或 BSA 进行封闭时,需留意抗体适配性与交叉反应问题,尤其是磷酸化抗体应避免使用牛奶封闭,必要时可直接更换特异性更强的单克隆抗体,从根源减少非特异性杂信号。
Q: WB 条带中间出现白色圆圈(白圈),该怎么解决?
A: WB 条带出现白圈现象,大多是转膜过程中产生气泡所造成,主要是转膜组装三明治结构时胶与膜之间残留气泡,阻碍了蛋白正常转移,也可能是转膜温度过高滋生气泡或是膜活化不充分所致;实验组装时需用玻璃棒轻轻滚压彻底排尽气泡,同时采用预冷转膜缓冲液,并全程在冰浴条件下进行转膜操作即可避免该问题。
Q: WB 条带出现 “微笑 / 皱眉” 形状,是什么问题?
A: WB 条带出现变形多与电泳操作环节密切相关,主要原因包括凝胶配制时聚合不均匀或内部残留气泡、电泳电压过高使凝胶发热造成蛋白迁移不均,以及上样量过大或样本盐浓度偏高干扰正常迁移速率;实际实验中可通过降低电泳运行电压、保证凝胶充分完全聚合、优化样本缓冲液配比等方式,有效改善条带变形的问题。
Q: 磷酸化蛋白 WB 实验中,条带总是检测不到,可能是什么原因?
A: 磷酸化蛋白的免疫印迹检测难度相对更高,实验失败大多源于样本处理环节,常见原因有蛋白提取过程中未添加磷酸酶抑制剂,致使磷酸化蛋白发生快速去磷酸化;磷酸化蛋白本身表达丰度偏低,实验上样量不足;转膜效率不佳,磷酸化蛋白无法完整有效地转移至膜上;另外抗体对磷酸化位点识别灵敏度不足,或是样本中目标磷酸化位点本身未被激活也会导致无条带。实验全程建议低温操作,同时优化蛋白裂解与转膜各项条件,即可明显提升磷酸化蛋白的检测成功率。
Q: WB 条带位置和预期分子量不符,该怎么排查?
A: 条带位置偏差的常见原因:① 蛋白存在翻译后修饰(如糖基化、磷酸化),会导致分子量偏移;② 存在转录异构体或蛋白剪切产物;③ 凝胶浓度选择不当(如小分子蛋白用高浓度胶);④ 电泳条件不稳定,导致迁移率异常。可结合文献和阳性对照验证条带特异性。
Q: WB 条带出现很多杂带,是什么原因?
A: WB 实验中条带出现杂带的主要成因包括:一抗特异性较差,存在非特异性结合;一抗或二抗浓度过高,导致非特异性信号增强;封闭不彻底,膜上的非特异性位点未被有效封闭;样本中蛋白发生降解或存在非特异性杂蛋白干扰;以及电泳时上样量过大,超出了抗体的识别能力。针对这些问题,可通过梯度稀释抗体找到最佳工作浓度、优化封闭条件以减少非特异性结合、增加样本纯化步骤来去除杂质,从而有效改善杂带问题。
Q: WB 背景很高、整片发黑,该怎么解决?
A: WB 实验中背景信号过高通常与封闭、抗体孵育及洗涤环节相关:首先要排查封闭是否充分,可通过延长封闭时间(如延长至 2 小时)或更换封闭液改善,例如使用 BSA 替代脱脂奶粉,避免内源性磷酸酶对磷酸化抗体检测的干扰;其次可能是抗体浓度过高,可适当降低一抗与二抗的稀释比例,减少非特异性结合;此外洗涤不充分也会导致背景升高,建议增加 TBST 的洗涤次数并延长每次洗涤的时间;最后还需注意实验操作的规范性,避免用手直接接触膜,使用干净的耗材,防止膜被污染而造成背景异常。
Q: WB 条带信号很弱,如何增强信号?
A: 可以从以下环节优化: ① 增加蛋白上样量(确认样本无降解); ② 降低一抗稀释比例,延长 4℃孵育时间; ③ 优化转膜条件,确保蛋白高效转移; ④ 使用灵敏度更高的发光试剂; ⑤ 调整曝光时间,或改用荧光 WB 系统提升检测限。
Q: WB 实验中完全没有条带信号,可能是什么原因?
A: 常见原因包括: ① 目的蛋白在样本中表达极低或不表达; ② 蛋白降解(未加足量蛋白酶抑制剂、反复冻融); ③ 转膜失败(蛋白未转移到膜上或转过凝胶); ④ 一抗 / 二抗不匹配、浓度过低或孵育时间不足; ⑤ 曝光时间过短或检测系统灵敏度不足。可通过加入阳性对照、优化转膜条件和抗体浓度排查。
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