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知识讲堂领域前沿常见问题

Molecular interaction

in situ hybridization

protein antibody

Q：WB 实验中完全没有条带信号，可能是什么原因？

A：常见原因包括： ① 目的蛋白在样本中表达极低或不表达； ② 蛋白降解（未加足量蛋白酶抑制剂、反复冻融）； ③ 转膜失败（蛋白未转移到膜上或转过凝胶）； ④ 一抗 / 二抗不匹配、浓度过低或孵育时间不足； ⑤ 曝光时间过短或检测系统灵敏度不足。可通过加入阳性对照、优化转膜条件和抗体浓度排查。

Q：对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？

A：对于贴壁细胞，采用转染试剂转染即可；对于比较难转染的细胞，为提高转染效率，可选购特殊要求的转染试剂或者使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法未必是最佳的；转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测等方法，但最终以达到基因过表达或者干扰的效率为准。

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