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知识讲堂领域前沿常见问题

Q：制备抗体时，对抗原 / 多肽送样有哪些关键要求？

A：蛋白抗原：分子量＞10 kDa、纯度≥85%、浓度 0.5–5 mg/mL，无叠氮钠 / 咪唑等杂质，甘油＜20%，附SDS-PAGE/WB 鉴定图。多肽抗原：偶联载体需总量＞6 mg、纯度≥80%；未偶联需总量＞10 mg、纯度≥90%，均需提供序列与鉴定报告。

Q：抗体在敲除 / 突变体样本中仍有信号，是什么原因？

A：常见原因有 4 点：①抗体识别同源蛋白表位（同家族蛋白共享表位）；②突变体构建未成功（未敲除目标表位）；③样本存在污染或代偿表达；④识别截短 / 突变前表位。建议提供测序验证报告与突变位点信息，结合阳性 / 阴性对照复测。

Q：IHC 实验无信号 / 信号弱，可能原因？

A：核心原因：抗原修复不足、抗体浓度低 / 孵育短、样本固定过度、抗原丢失、抗体不识别石蜡切片。解决：优化抗原修复（HIER 高温修复）、提高一抗浓度 / 4℃过夜、控制固定时间、用经验证的 IHC 抗体。

Q：WB 实验背景高、非特异条带多，常见原因与解决办法？

A：常见原因：一抗 / 二抗浓度过高、封闭不足、孵育时间过长、洗涤不充分、样品降解。解决：降低抗体浓度、延长封闭（5% 脱脂奶 / BSA，1–2 h）、缩短孵育、增加洗涤次数、加蛋白酶抑制剂。

Q：抗体出现沉淀 / 聚集还能用吗？怎么处理？

A：轻微沉淀 / 聚集不影响活性。处理：室温轻柔颠倒混匀；或4℃离心（1000×g，5 min）取上清，过滤（0.22 μm）也可，不影响核心活性。避免剧烈震荡或反复冻融。

Q：抗体正确保存条件是什么？需要分装吗？有效期多久？

A：含 50% 甘油抗体：-20℃避光保存，勿冻融，无需分装（防污染 / 效价损失）；无甘油（PBS 体系）：-80℃保存，建议无菌分装避免反复冻融。有效期：原装未开封 1 年（质保），妥善保存可稳定≥5 年。

Q：抗体浓度越高效果越好吗？浓度低会影响结果吗？

A：不是。抗体按免疫活性效价配比，非浓度越高越好。只要在说明书推荐稀释比（如 WB：0.1–1 μg/mL）内，低浓度高活性抗体效果更优；浓度过高易导致非特异性结合、背景高。

Q：抗体标注分子量与 WB 实际条带不一致，正常吗？

A：正常。常见原因：①翻译后修饰（磷酸化、糖基化等增加分子量）；②剪接变体 / 同工型；③蛋白多聚体 / 降解；④凝胶迁移或电荷差异。建议参考说明书预期条带，结合文献与阳性对照验证。

Q：同一靶点有多个货号 / 克隆号，核心差异是什么？

A：核心差异是免疫原、表位、宿主、验证应用与批次稳定性。克隆号代表单抗的独特细胞株，同克隆号 = 同抗体；不同克隆号识别不同表位，适用实验（如 WB/IHC）与性能（特异性 / 灵敏度）可能不同。