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Q：构建稳转细胞株时，筛选抗生素的合适浓度该怎么确定？
A：需先做预实验，设置 5-8 个浓度梯度处理未转染亲本细胞，以 3-7 天内杀死所有细胞的最低浓度作为筛选浓度；筛选期维持该浓度，稳定传代后可适当降低维持浓度，避免细胞表型变化。
Q：细胞冻存复苏后，存活率低、状态差是什么原因？如何优化？
A：常见原因包括冻存液配方不合适、降温速率不当、复苏时水浴温度过高、离心操作粗暴。优化可采用含 10% DMSO + 胎牛血清的标准冻存液，用程序降温盒梯度降温，复苏时 37℃快速融化后立即稀释培养基，低速离心去除 DMSO 并避免直接吹打细胞。
Q：流式检测外泌体时，如何区分真实信号与背景噪音？有哪些质控方法？
A：常见质控包括：1）空白对照（PBS + 同型对照抗体）确定背景阈值；2）单染对照区分荧光溢漏；3）已知粒径的荧光微球校准仪器；4）CD81/CD63 等阴性样本对照排除非特异性结合。此外，设置未染色、只加二抗的对照，可有效排除二抗的非特异性信号干扰。
Q：外泌体 RNA 测序（exoRNA-seq）时，样本制备需要注意哪些关键点？
A：关键控制点包括：1）严格去除细胞碎片和脂蛋白污染，建议用超速离心 + 过滤法双重纯化；2）避免 RNA 酶污染，全程使用无 RNA 酶耗材并添加抑制剂；3）低起始量优化，外泌体 RNA 总量极低，需使用专门的微量建库试剂盒；4）数据质控需关注 rRNA 残留率，外泌体中 rRNA 含量通常极低，若过高提示样本污染。
Q：外泌体给药时，如何确定合适的给药浓度和途径？不同给药方式的优缺点是什么？
A：给药浓度通常需根据外泌体的蛋白浓度或颗粒数进行换算，建议预实验设置梯度（如 1×10⁸-1×10¹⁰颗粒 / 只小鼠）。给药途径：尾静脉注射适用于全身循环研究；腹腔注射操作简便但吸收慢；局部注射（如肿瘤原位注射）靶向性好；鼻腔 / 肺部给药适合呼吸道疾病模型，不同途径的生物分布和代谢动力学差异较大，需结合研究目的选择。
Q：外泌体提取时，超速离心法和试剂盒法各有什么优缺点？该如何选择？
A：超速离心法：纯度高、成本低，但操作繁琐、耗时长，对设备要求高，且可能破坏外泌体结构；试剂盒法（如 PEG 沉淀法）操作简便、通量高，但纯度较低，易残留杂蛋白和脂蛋白。选择建议：追求高纯度做电镜 / 质谱分析选超速离心法；大样本量、做 WB/qPCR 或初筛实验可选试剂盒法。
Q：外泌体样本如何长期保存？不同保存条件对后续实验影响大吗？
A：短期保存（1-2 周）：4℃可稳定保存不超过 72 小时；长期保存建议分装后置于 - 80℃冰箱，避免反复冻融（每次冻融会导致约 10-30% 的外泌体破裂）。不同保存条件对实验影响显著：-20℃保存会导致外泌体聚集、蛋白降解，不推荐；添加 5-10% 甘油可提高冷冻稳定性，但可能影响后续电镜和 NTA 检测。
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